Oxidación anaeróbica de propano acoplada a reducción de nitrato por un linaje dentro de la clase Symbiobacteriia - Productos químicos Co., Ltd de Shijiazhuang

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 6115 (2022) Citar este artículo

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Se cree que los microorganismos anaeróbicos desempeñan un papel fundamental en la regulación del flujo de alcanos gaseosos de cadena corta (SCGA; incluidos etano, propano y butano) desde los ecosistemas terrestres y acuáticos a la atmósfera. Se ha confirmado que el sulfato actúa como aceptor de electrones que favorece la oxidación anaeróbica microbiana de los SCGA; sin embargo, varios otros aceptores energéticamente más favorables coexisten con estos gases en entornos anaeróbicos. Aquí, mostramos que un biorreactor sembrado con biomasa de una instalación de tratamiento de aguas residuales puede realizar oxidación anaeróbica de propano junto con la reducción de nitrato a gas dinitrógeno y amonio. El biorreactor estuvo en funcionamiento durante más de 1000 días y utilizamos experimentos de marcaje con 13C y 15N, análisis metagenómicos, metatranscriptómicos, metaproteómicos y de metabolitos para caracterizar la comunidad microbiana y los procesos metabólicos. Los datos en conjunto sugieren que una especie que representa un nuevo orden dentro de la clase bacteriana Symbiobacteriia es responsable de la oxidación de propano dependiente de nitrato observada. El genoma cerrado de este organismo, que denominamos 'Candidatus Alkanivorans nitratireducens', codifica vías para la oxidación del propano a CO2 mediante la adición de fumarato y para la reducción de nitratos, con todos los genes clave expresados durante la oxidación del propano dependiente de nitratos. Nuestros resultados sugieren que el nitrato es un sumidero de electrones relevante para la oxidación de SCGA en ambientes anaeróbicos, constituyendo un nuevo vínculo mediado por microbios entre los ciclos del carbono y el nitrógeno.

Una cantidad considerable de gas natural se genera a partir de sedimentos de aguas profundas y filtraciones de hidrocarburos en los márgenes continentales y ecosistemas terrestres1,2. La mayor parte del gas natural liberado es consumido por microorganismos en zonas anóxicas antes de que el gas se difunda hacia ambientes óxicos y la atmósfera3,4,5. Los estudios de oxidación anaeróbica del gas natural se han centrado en el potente gas de efecto invernadero, el metano, como el componente más abundante (~60–90%)6,7. Sin embargo, los alcanos gaseosos de cadena corta (SCGA), incluidos el etano, propano, n-butano e isobutano, también son constituyentes sustanciales del gas natural (hasta ~20%)8 y son precursores importantes del ozono y los aerosoles orgánicos9. Se estima que las emisiones atmosféricas globales de los SCGA son de 9,2 a 9,6 Tg año-1 para el etano, 9,6 a 10,5 Tg año-1 para el propano, 10 Tg año-1 para el butano y 4,2 Tg año-1 para el isobutano10.

La oxidación anaeróbica del metano (OMA) se ha estudiado ampliamente y se comprende relativamente bien7,11,12,13,14,15,16,17. Las arqueas metanotróficas anaeróbicas (ANME) oxidan el metano a través de la vía de metanogénesis inversa, incluido el complejo clave metil-CoM reductasa (MCR). El ANME transporta electrones del metano a bacterias reductoras de sulfato sintróficas (SRB)11,12 o directamente a la reducción de nitratos y óxidos metálicos13,14,15,16. La bacteria 'Candidatus Methylomirabilis oxyfera' realiza OMA a través de la vía de oxidación de metano “intraaeróbica” utilizando nitrito como único aceptor de electrones17. Es probable que los microorganismos también combinen la oxidación de los SCGA con la reducción de estos aceptores de electrones en condiciones anóxicas18. 'California. M. oxyfera' demostró ser capaz de oxidar etano y propano a través de la metano monooxigenasa, aunque aún está por demostrar si estas fuentes de carbono apoyan el crecimiento19. Hasta la fecha, el sulfato ha sido el único sumidero de electrones identificado que respalda la oxidación anaeróbica de SCGA20,21,22,23,24,25. El aislado deltaproteobacteriano Desulfosarcina aeriophaga BuS5 oxida propano y butano a través de la vía de adición de fumarato generando succinatos sustituidos con alquilo, un proceso mediado por la alquilsuccinato sintasa (ASS)20,21, y reduce directamente el sulfato a sulfuro. Se descubrió que un enriquecimiento de la arqueona 'Candidatus Syntrophoarchaeum' activa el butano mediante la formación de butil-coenzima M, un proceso catalizado por una MCR divergente, con equivalentes reductores canalizados hacia socios SRB sintróficos23. De manera similar, la oxidación anaeróbica de etano se relacionó con el 'Candidatus Argoarchaeum ethanivorans' relacionado, que también codificaba un complejo similar a MCR y se sugirió que formaba una relación sintrófica con SRB22. Sin embargo, aún no se ha identificado una arqueona capaz de mediar la oxidación anaeróbica del propano directamente acoplada a la reducción de sulfato.

Al igual que el sulfato, el nitrato es un aceptor de electrones común en los ecosistemas naturales26 y es utilizado por la arqueona ANME 'Ca. Methanoperedens nitroreducens' para OMA13. La reducción de nitrato acoplada a la oxidación de SCGA (Ec. (1), usando propano como ejemplo) también es más termodinámicamente factible en comparación con las reacciones de oxidación de SCGA acoplada a la reducción de sulfato (△Go'= −102 kJ/mol propano)20 , pero aún no se ha relacionado con ningún linaje microbiano.

Aquí combinamos pruebas de balance de masa y electrones, experimentos de etiquetado con 13C y 15N, secuenciación de amplicones del gen 16S rRNA, análisis de metabolitos y enfoques multiómicos para proporcionar evidencia de que una nueva especie bacteriana dentro de la clase Symbiobacteriia realiza una oxidación anaeróbica de propano acoplado a nitrato. reducción.

En este estudio, un biorreactor anaeróbico sembrado con biomasa procedente de una instalación de tratamiento de aguas residuales fue alimentado mediante impulsos con propano y nitrato durante más de 1.000 días. Los datos de rendimiento a largo plazo mostraron un consumo simultáneo de propano y nitrato, con acumulación de amonio, gas dinitrógeno y acumulación transitoria de nitrito (Figura 1 complementaria). No se observó consumo de nitrato en las incubaciones de control (sin la adición de biomasa de cultivo de enriquecimiento o propano, figura complementaria 2), lo que sugiere que la reducción de nitrato (a nitrito, amonio y N2) junto con el consumo de propano en el biorreactor fue mediada microbianamente. Para confirmar la reacción de oxidación anaeróbica del propano dependiente de nitrato y verificar los productos finales de la misma, se incubó biomasa del reactor principal en experimentos por lotes con propano marcado con 13C (13CH313CH213CH3) y nitrato marcado con 15N (15NO3-) añadidos a ~8%. y ~1% del propano total y nitrato total, respectivamente. La cantidad de CO2 total y CO2 marcado con 13C aumentó, acompañado de una disminución de C3H8 y 13C3H8 (Fig. 1a, b). La relación (2,42) entre el 13CO2 total producido (46 μmol) y el 13C3H8 total consumido (19 μmol) estuvo cerca de la relación estequiométrica teórica de 3:1. El balance de carbono sugiere que el propano se oxidó con CO2 como producto final. El consumo total de NO3− (0,73 mmol) fue consistente con la producción total combinada de N2 y NH4+ (0,8 mmol) (Fig. 1c). De manera similar, el consumo de 15NO3− (9,38 μmol) estuvo cerca del 15N en 29N2 (1,1–1,5% del N2 total), 30N2 (0,03% del N2 total) y 15NH4+ producidos, que ascendieron a 9,71 μmol en combinación (Fig. 1d). Estos resultados confirmaron la reducción del nitrato a gas dinitrógeno y amonio. Los electrones generados por la oxidación anaeróbica de propano (AOP, 5,03 mmol) estuvieron cerca de la demanda de electrones para la reducción de NO3- a N2 y NH4+ (5,15 mmol), lo que sugiere que los electrones generados por AOP se usaron para la desnitrificación y la reducción disimilatoria de nitrato a amoníaco (DNRA). ), consistente con las siguientes reacciones27:

a Conversión de C3H8 a CO2, b 13C3H8 a 13CO2, c NO3− a NH4+ y N2 con formación transitoria de NO2−, d 15NO3− a 15NH4+ y 29N2 con formación transitoria de 15NO2−. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Se realizaron experimentos estequiométricos tanto en el reactor principal como en incubaciones discontinuas sembradas con biomasa del sistema principal, para establecer con mayor precisión los equilibrios de nitrógeno y electrones. La reducción de nitrato/nitrito pareció ocurrir en dos etapas distintas (Fig. 2a). En la Etapa 1 (antes del agotamiento del nitrato), el nitrato se convirtió en nitrito y gas dinitrógeno con una producción insignificante de amonio. En la Etapa 2 (después del agotamiento de nitrato), se generaron tanto gas dinitrógeno como amonio a partir del nitrito acumulado en la Etapa 1. La observación de que la DNRA ocurrió predominantemente cuando el nitrato se volvió limitante es consistente con estudios previos28,29,30. La relación entre el consumo de nitrato y el gas dinitrógeno y la producción de amonio en pruebas por lotes por triplicado (Fig. 2a, Fig. 3 complementaria) fue de 1,03 ± 0,05 (Fig. 2b, Tabla 1 complementaria), lo que sugiere que el nitrato finalmente se convirtió completamente en gas dinitrógeno ( 57,3 ± 5,5%) y amonio (42,7 ± 5,5%). La relación entre la producción de electrones (calculada a partir de la oxidación de propano a CO2) y el consumo de electrones (reducción de nitrato) fue de 1,10 ± 0,01 (Fig. 2b, Tabla complementaria 1), lo que sugiere que la reducción de nitrato fue el principal sumidero de electrones para la oxidación de propano.

a Perfil bioquímico típico de los sistemas (comenzado el día 1050) que muestra consumo simultáneo de nitrato y propano con formación transitoria de nitrito y producción de gas dinitrógeno y amonio. La reducción de nitratos pareció ocurrir en dos fases distintas. En la Etapa 1, el nitrato se convirtió en nitrito y gas dinitrógeno con una producción insignificante de amonio; mientras que en la Etapa 2, tanto el gas dinitrógeno como el amonio se generaron a partir del nitrito acumulado. b Los balances promedio de nitrógeno y electrones se calcularon a partir de las tres pruebas por lotes (para obtener datos y cálculos completos, consulte la Tabla complementaria 1). Las barras de error representan errores estándar. Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

El perfil de la comunidad con la secuenciación del amplicón del gen 16S rRNA reveló que un filotipo bacteriano perteneciente a un linaje no clasificado dentro del filo Firmicutes era la población más abundante en el biorreactor (20,1 % el día 985, figura complementaria 4), a pesar de ser indetectable en el inóculo. Para obtener un genoma representativo de la población dominante, se realizó una secuenciación metagenómica de lectura larga (Nanopore) y de lectura corta (Illumina) (Datos suplementarios 1) en la biomasa del biorreactor muestreado el día 1040. El ensamblaje y la agrupación de los datos metagenómicos condujeron a la recuperación. de 59 genomas casi completos (≥70% de integridad y ≤10% de contaminación según CheckM, Datos complementarios 1, Figura complementaria 5), incluidos 11 genomas circularizados completos (Datos complementarios 1). La población más abundante se clasificó con la Base de datos de taxonomía del genoma (GTDB) para representar un orden novedoso dentro de la clase Symbiobacteriia del filo Firmicutes (22,8% de la abundancia relativa, Tabla complementaria 2). Proponemos el nombre 'Candidatus Alkanivorans nitratireducens' para esta bacteria en función de su capacidad de degradación del propano dependiente de nitrato (ver más abajo). El gen 16S rRNA (1536 pb) recuperado del 'Ca. El MAG de A. nitratireducens era idéntico a la abundante secuencia del amplicón del gen 16S rRNA afiliado a Firmicutes. La CA. El MAG de A. nitratireducens estaba completo y circularizado con un tamaño de 2,43 Mbp (Figura complementaria 6). Un árbol filogenético basado en el genoma mostró que el 'Ca. A. nitratireducens era filogenéticamente distinta de Symbiobacteriia disponible públicamente (Fig. 3a). La identidad de nucleótidos (ANI) y la identidad de aminoácidos (AAI) promedio de 'Ca. El genoma de A. nitratireducens, en comparación con el de sus parientes más cercanos en GTDB, es decir, Symbiobacteriia ZC4RG38, Symbiobacterium sp003242675 y Symbiobacterium thermophilum (<75,0% y 53,8–55,2% para ANI y AAI, respectivamente), respalda la clasificación de 'Ca. A. nitratireducens' como un nuevo orden dentro de la clase Symbiobacteriia31. El árbol del gen 16S rRNA (Figura complementaria 7) también revela que el 'Ca. A. nitratireducens está filogenéticamente distante de otras Symbiobacteriia clasificadas (<84,1% de identidad del gen 16S rRNA)31 y no tiene parientes cercanos en la base de datos Silva. Se diseñaron y aplicaron individualmente tres sondas FISH (SYMB-1018, SYMB-624 y SYMB-186) a la biomasa del biorreactor para visualizar la morfología y la disposición espacial del 'Ca. Células de A. nitratireducens. El examen microscópico de la biomasa reveló flóculos difusos con las células que parecían estar incrustadas en una matriz extracelular similar a una sustancia polimérica. 'California. A. nitratireducens apareció como células incrustadas en forma de varilla (~ 0,5 µm × 1,5 µm) que a veces formaban agregados (hasta ~ 50 µm) y eran abundantes y relativamente uniformemente dispersas en los flóculos (Fig. 3b y Fig. complementaria 8). La morfología y la disposición espacial de las células fueron consistentes para las tres sondas, lo que da confianza en su especificidad (Figura complementaria 8).

un árbol filogenético basado en el genoma. La CA. El genoma de A. nitratireducens de este estudio está resaltado en texto rojo. Los puntos blancos y negros representan valores de arranque >90% y >70%, respectivamente. Las barras de escala indican sustituciones de aminoácidos por sitio. b Una micrografía de fluorescencia compuesta del cultivo de enriquecimiento hibridado con la sonda FISH SYMB-1018 (Cy3, rojo; dirigida a 'Ca. A. nitratireducens') y teñida con DAPI (azul; todas las células microbianas). 'California. Las células de A. nitratireducens aparecen de color magenta (azul + rojo). La barra de escala indica 20 μm. La imagen representativa se seleccionó basándose en la evaluación visual de seis experimentos de hibridación separados. También se obtuvieron resultados consistentes de forma independiente con dos sondas adicionales dirigidas al 'Ca. Población de A. nitratireducens (Figura complementaria 8). c, d Expresión relativa de cada genoma y cóntigos no agrupados, y metabolismo microbiano de interés para los genomas en el biorreactor. Se calcularon las transcripciones totales por millón (TPM) para cada gen. Se muestran conjuntos de genomas con expresión general de TPM total> 1% (c). La anotación KEGG se utilizó para identificar ORF que codifican las vías de desnitrificación (M00529) y reducción disimilatoria de nitrato a amonio (M00530) (d). Los datos de origen se proporcionan como un archivo de datos de origen.

Anotación del 'Ca. El MAG de A. nitratireducens identificó genes para un complejo ASS que incluye dos subunidades AssD (secuencias de aminoácidos idénticas) y tres subunidades AssA (89,3–90,7% de similitudes en las secuencias de aminoácidos, figura complementaria 9), que median el primer paso de la activación anaeróbica de SCGA mediante adición de fumarato20,32. Alineación de 'Ca. Las secuencias de aminoácidos AssA de A. nitratireducens con secuencias homólogas en la base de datos NCBI confirmaron la conservación de residuos de aminoácidos clave (Gly828 y Cys489 en AssA1, Gly501 y Cys169 en AssA2, Gly828 y Cys489 en AssA3, Figura complementaria 10), que son importante para la función de las enzimas que añaden fumarato33. Los análisis filogenéticos revelaron que AssA y AssD de 'Ca. A. nitratireducens están filogenéticamente distantes de las enzimas de adición de fumarato (AssAD y BssAD) en las bases de datos NCBI y UniRef (Fig. 4c; Fig. 11 complementaria). Además, el 'Ca. El MAG de A. nitratireducens alberga todos los genes necesarios para la degradación adicional del propilsuccinato/isopropilsuccinato, incluidos los genes de la metilmalonil-CoA mutasa (mcmA) para el reordenamiento del esqueleto de carbono, los genes de la propionil-CoA carboxilasa (pccB) para la descarboxilación y los genes clave para beta-oxidación34,35 (Fig. 5; Datos complementarios 2). El acetil-CoA generado a partir de la beta-oxidación puede ingresar al ciclo oxidativo del ácido tricarboxílico (TCA) para una oxidación completa a CO2 o para la regeneración de fumarato para rondas posteriores de activación de propano (Fig. 5). El isobutiril-CoA podría oxidarse, mediante semialdehído metilmalónico, a propionil-CoA36, que podría utilizarse para regenerar fumarato mediante la vía del metilmalonil-CoA (Fig. 5). Se identificaron genes para CO deshidrogenasa: acetil-CoA sintasa (CODH / ACS) y la vía inversa de Wood-Ljungdahl (WL) en 'Ca. A. nitratireducens', lo que sugiere que la oxidación terminal de acetil-CoA a CO2 puede estar mediada por CODH/ACS y la deshidrogenación gradual de las unidades C1 derivadas37,38 (Fig. 5; Datos complementarios 2; Tabla complementaria 3). Esta vía WL para la producción de CO2 es consistente con la propuesta para el propano dependiente de sulfato que degrada Desulfosarcina aeriophaga BuS521. Actualmente, la clase de Symbiobacteriia solo incluye 3 genomas en la base de datos GTDB y no hay modelos metabólicos disponibles para los metabolismos anaeróbicos del propano. Por lo tanto, se requieren más estudios para construir modelos metabólicos para 'Ca. A. nitratireducens' para calcular los flujos de carbono de las vías TCA y WL y comprender cómo las células regulan estas dos vías.

a Los cromatogramas iónicos parciales (transición iónica, m/z: 289 > 147,2) de los extractos de cultivo enriquecidos (n = 3, tomados en varios momentos) revelaron un pico en el tiempo de retención de 10,832 min, que coincide con el pico del estándar de isopropilsuccinato. . b Se observó un pico en el tiempo de retención de 11,078 min (transición iónica, m/z: 289 > 147,1), correspondiente al pico del estándar de propilsuccinato, para los extractos celulares del cultivo enriquecido (n = 3 en diferentes puntos de muestreo). c Relación filogenética de 'Ca. AssA (rojo) de A. nitratireducens a otros AssA y BssA en la base de datos del NCBI. Tres subunidades de AssA (AssA123) encontradas en 'Ca. El MAG de A. nitratireducens formó un grupo separado. Los valores de Bootstrap >90% se muestran como puntos negros en los nodos de rama. La barra de escala representa sustituciones de aminoácidos por sitio.

La CA. El cultivo de enriquecimiento de A. nitratireducens utilizó una alquilsuccinato sintasa para activar el propano a n- e isopropilsuccinato. La acetil-CoA se produce después de la reordenación del esqueleto de carbono, la descarboxilación y la betaoxidación. La oxidación de acetil-CoA a CO2 es catalizada por enzimas implicadas en el ciclo oxidativo del ácido tricarboxílico o la vía inversa de Wood-Ljungdahl (etiquetas moradas). 'California. A. nitratireducens albergaba todas las enzimas implicadas en la desnitrificación (NapAB, NorB, NosZ, excepto NirS/K) y los procesos DNRA (NapAB, NrfAH) (texto verde). Expresión genética normalizada para 'Ca. A. nitratireducens se indica como TPM (transcripciones totales por millón). El aumento del grosor de la línea muestra valores crecientes de expresión genética. Las enzimas etiquetadas en azul, verde, morado y negrita se identificaron total o parcialmente en los extractos de proteínas, mientras que el texto rojo indica que no se detectaron enzimas. Alquilsuccinato sintasa, Ass; Acil-CoA sintetasa de cadena larga, FadD; Metilmalonil-CoA mutasa, Mcm; propionil-CoA carboxilasa, Pcc; Succinato-CoA ligasa, Suc; Succinato deshidrogenasa, Sdh; ácido tricarboxílico, TCA; CO deshidrogenasa: acetil-CoA sintasa, CODH/ACS; Metilentetrahidrofolato deshidrogenasa, Mthfd; metilentetrahidrofolato reductasa, Mthfr; Formiltetrahidrofolato deformilasa, Fthd; formiato deshidrogenasa, Fdh; ATPasa transportadora de H+ tipo F, ATP; NADH-quinona oxidorreductasa, Nuo; Antiportador Na+ H+ multicomponente, Mnh; Menaquinol, MKH2; Menaquinona, MK; Nitrato reductasa, Nap; Citocromo c 552 nitrito reductasa, Nrf; Óxido nítrico reductasa, Nor; Óxido nitroso reductasa, Nos.

Los análisis metatranscriptómicos y metaproteómicos revelaron que los genes implicados en las vías propuestas para la oxidación anaeróbica completa del propano a CO2 se expresaban altamente en 'Ca. A. nitratireducens 'y sus productos genéticos correspondientes también se detectaron en extractos de proteínas después de la adición de propano (con formiltetrahidrofolato deformilasa y formiato deshidrogenasa como excepciones, Fig. 5; Datos complementarios 2), lo que indica 'Ca. A. nitratireducens desempeñó un papel activo en la AOP durante las etapas 1 y 2. Una búsqueda en toda la biblioteca de metagenomas sugirió que ninguna otra población en el sistema codificaba genes conocidos vinculados a la AOP, incluidos los genes de ASS20,32 y la alquil-coenzima M reductasa22. ,23. La actividad relativa de las poblaciones microbianas coexistentes (que en conjunto representan del 14 al 22% del total de lecturas del transcriptoma) también fue sustancialmente menor que la del 'Ca. A. nitratireducens '(64–83% del total de lecturas del transcriptoma, Fig. 3c). Estos resultados sugieren fuertemente que 'Ca. A. nitratireducens era responsable del AOP en el sistema.

Se analizaron extractos celulares de la biomasa de enriquecimiento en busca de metabolitos clave de la vía de activación mediante espectrometría de masas de triple cuadrupolo de ultra alta sensibilidad. Los cromatogramas de iones totales indicaron un tiempo de retención idéntico para los estándares de propilsuccinato y los metabolitos extraídos (Figura complementaria 12). Se detectaron picos de masa correspondientes a los estándares de isopropilsuccinato (m/z: 289 > 147,2) y propilsuccinato (m/z: 289 > 147,1) en los extractos celulares (Fig. 4a, b). Estos hallazgos apoyan la hipótesis de que 'Ca. A. nitratireducens activa el propano mediante la escisión homolítica del enlace CH en los átomos de carbono primarios y secundarios y, con la adición de fumarato, produce propilsuccinato e isopropilsuccinato. Además, el isopropilsuccinato (5,96 nM) fue más abundante que el propilsuccinato (2,33 nM) en los extractos de cultivo, lo que sugiere que la activación del átomo de carbono secundario que genera el isopropilsuccinato es la ruta principal de oxidación del propano (Fig. 5).

La CA. El MAG de A. nitratireducens también contiene todos los genes necesarios para DNRA (Fig. 5; Tabla complementaria 4), incluida una nitrato reductasa (napAB) que cataliza la reducción de nitrato a nitrito, y citocromo c nitrito reductasas (nrfAH) responsables de reducir generó nitrito a amonio. Los resultados metatranscriptómicos revelaron que los genes napAB codificados por 'Ca. A. nitratireducens se expresaron más en la Etapa 1 en relación con la Etapa 2, lo que coincide con la mayor concentración de nitrato en la Etapa 1 (Figura complementaria 13a). Además, 'Ca. El nrfAH de A. nitratireducens se expresó altamente en la Etapa 2, donde se generó la mayor parte del amonio (Figura complementaria 13b). Además, las subunidades catalíticas de la nitrato reductasa (NapAB) y la nitrito reductasa del citocromo c (NrfA) también se identificaron en extractos de proteínas (Fig. 5; Tabla complementaria 4). Otros miembros de la comunidad también expresaron genes para las vías de reducción disimilatoria de nitrato (desnitrificación y DNRA; Fig. 3d), pero en niveles sustancialmente más bajos en comparación con 'Ca. A. nitratireducens'.

La contribución de 'Ca. La relación de A. nitratireducens con la producción observada de gas dinitrógeno no está completamente clara dado que el MAG representativo cerrado carece de una nitrito reductasa productora de óxido nítrico identificable (nirS/K). El MAG tiene el potencial anotado para los dos últimos pasos de la desnitrificación; codifica óxido nítrico reductasa (norB) y óxido nitroso reductasa (nosZD) para la conversión de óxido nítrico en gas dinitrógeno (Fig. 5; Tabla complementaria 4). Estos genes se expresaron altamente en ambas etapas y se detectaron en los extractos de proteínas (Tabla complementaria 4), lo que indica que este microorganismo está contribuyendo a la reducción del óxido nítrico a gas dinitrógeno. Estas observaciones sugieren que 'Ca. A. nitratireducens puede utilizar un gen novedoso o una vía novedosa para la reducción de nitrito a óxido nítrico. De hecho, se ha informado que varios otros microbios, como Bacillus vireti y bacterias metilotróficas, producen óxido nítrico a pesar de que no albergan genes nirS/K39,40,41. También es posible que otros miembros de la comunidad contribuyan a la desnitrificación observada a gas dinitrógeno o a la reducción de nitrito a óxido nítrico. Sin embargo, la expresión de los genes nirS/K y otros genes de desnitrificación fue relativamente baja para todas las demás poblaciones (Fig. 3d), lo que sugiere que 'Ca. A. nitratireducens fue responsable de la mayor parte de las transformaciones de nitrógeno y carbono en el sistema.

La identificación de un firmicute anaeróbico que oxida propano expande la diversidad filogenética conocida de linajes microbianos que median la oxidación anaeróbica de SCGA en el medio ambiente, como se demostró previamente para miembros de las Deltaproteobacterias y el filo de arqueas Halobacteriota. Hasta donde sabemos, este estudio es el primero en identificar un microorganismo que media la oxidación anaeróbica del propano dependiente de nitrato (n-DAPO). Dada la prevalencia de nitrato en diversos ecosistemas naturales y artificiales, combinada con el aumento de las emisiones atmosféricas de propano debido a la producción de petróleo y gas natural42, el proceso n-DAPO no descrito anteriormente probablemente ocurre en entornos naturales, lo que representa un vínculo pasado por alto entre el ciclo global del carbono y el nitrógeno. . El proceso n-DAPO recientemente descubierto puede desempeñar un papel importante en la reducción del impacto negativo del propano en la calidad del aire y el clima, lo que justifica más investigaciones. Aunque el propano es un gas de efecto invernadero menos potente en comparación con el metano, puede reaccionar con el radical hidroxilo, lo que resulta en una mayor producción de ozono9,43. Además, el propano contribuye a la formación de NO2 y nitrato de peroxiacetilo, dos importantes contaminantes del aire43. La identificación y caracterización de 'Ca. A. nitratireducens' contribuye a una mejor comprensión del papel de los microorganismos en la regulación de las emisiones de SCGA.

Alkanivorans (al.ka.ni.vo'rans. NL neut. n. alkanum, alcano; L. pres. part. vorans, devorador; NL masc. n. Alkanivorans, un comedor de alcanos). nitratireducens (ni.tra.ti.re.du'cens. NL masc. n. nitras (gen. nitratis), nitrato; L. pres. part. reducens, convirtiendo a un estado diferente; NL part. adj. nitratireducens, reduciendo nitrato). Este nombre implica un organismo capaz de consumir propano y reducir los compuestos relacionados con el nitrógeno.

Enriquecido a partir de una mezcla de lodos de digestión anaeróbica y lodos activados de una planta de tratamiento de aguas residuales en Brisbane, Australia.

Bacterias anaeróbicas, oxidantes de propano y reductoras de nitratos, típicamente observadas como células en forma de bacilo de aproximadamente 0,5 (diámetro) × 1,5 µm (longitud), que a veces forman grupos. Mesófilo en términos de temperatura y pH (enriquecido a 22–25 °C y pH 7–8).

Sin un fácil acceso a los sedimentos en un ambiente rico en propano, como filtraciones de gas en aguas profundas o sedimentos de aguas termales, una mezcla de aproximadamente 100 ml de lodo de digestión anaeróbica y 50 ml de lodo activado de una planta de tratamiento de aguas residuales a gran escala ( Brisbane, Australia) se utilizó como inóculo para el enriquecimiento del biorreactor. Las aguas residuales suelen contener una amplia gama de sustratos orgánicos que permiten el crecimiento de una amplia gama de microorganismos. Además, también podrían generarse pequeñas cantidades de propano en los sistemas de digestión anaeróbica44. Nuestra hipótesis es que algunos microorganismos oxidantes del propano podrían estar presentes en tales sistemas. El inóculo se incubó en un biorreactor de 2,3 L con 1,84 L de medio sintético anóxico preparado como se describió anteriormente45, dejando un espacio de cabeza de 0,46 L. La presión parcial de propano en el espacio de cabeza se mantuvo entre 0,9 y 1,4 atm lavando periódicamente el líquido y el espacio de cabeza con agua pura. gas propano (99,99%, Coregas, Australia). Se inyectó helio manualmente en el espacio de cabeza para presurizar el reactor hasta 1,5 atm. El nitrato se alimentó por impulsos al reactor mediante inyección manual de una solución madre concentrada (80 g NO3--N l-1). El biorreactor se mezcló continuamente con un agitador magnético (IKA, Labtek, Australia) a 400 rpm y se incubó a temperatura ambiente (22 ± 2 °C). El pH se controló entre 7 y 7,5 añadiendo manualmente una solución de HCl anóxico 1 M. Cada 1 a 3 meses, se intercambiaron 200 ml del sobrenadante por medio sintético nuevo. Se extrajo una muestra líquida (un ml) 2 a 3 veces por semana a través del puerto de muestreo del biorreactor y se filtró 0,22 μm (filtro de polietersulfona, Millex, EE. UU.) para medir nitrato, nitrito y amonio. Se tomó una muestra de gas (100 μL) del espacio de cabeza usando una jeringa hermética (Hamilton, EE. UU.) 2 a 3 veces por semana para medir el gas propano y dinitrógeno.

Para la determinación estequiométrica de la reducción de nitrato y la oxidación anaeróbica de propano, se midieron periódicamente las concentraciones de propano y nitrógeno en el espacio de cabeza del biorreactor de 2,3 L, además de nitrato, nitrito y amonio, desde el día 990 al 1000. Además, también se realizaron dos pruebas por lotes en Recipientes de vidrio de 650 ml con una submuestra de 500 ml de biomasa transferida anaeróbicamente desde el biorreactor de 2,3 L (Tabla complementaria 5). Luego, la biomasa se lavó con gas argón (99,99 %, Coregas, Australia) durante 20 minutos para eliminar el propano disuelto en el líquido. Se agregaron aproximadamente 45 ml de gas propano al espacio de cabeza como único donante de electrones. Se establecieron como controles cultivos enriquecidos sin propano y medio sintético estéril con propano (Tabla complementaria 5). Cada prueba por lotes se realizó por triplicado.

Para los experimentos de marcaje de isótopos, se transfirió anaeróbicamente una submuestra de 500 ml de biomasa del biorreactor a un recipiente de vidrio de 650 ml. La biomasa se lavó con gas propano puro (99,99 %, Coregas, Australia) durante 20 min. Se inyectaron aproximadamente 12 ml de propano marcado con 13C (13CH313CH213CH3, 99% atómico de 13C, Sigma) en el espacio de cabeza a través del tabique. Se añadió aproximadamente 1 ml de solución madre de nitrato (10 g de NL-1) que contenía ~1 % de nitrato de sodio marcado con 15 N (98 % de átomos de 15 N, Sigma) para lograr una concentración de ~20 mg de NL-1. Utilizando una jeringa hermética, se tomaron muestras de gas periódicamente del espacio de cabeza (Hamilton, EE. UU.) y luego se inyectaron en viales llenos de helio (Exetainer, Reino Unido). Se recogieron muestras líquidas, se filtraron (0,22 μm) y se almacenaron a −20 °C hasta el análisis de 15NO3−, 15NO2− y 15NH4+. Para cuantificar el CO2 producido en la fase líquida, se inyectaron muestras sin filtrar en viales de Exetainer, se acidificaron con una solución de HCl 1 M y se equilibraron con el espacio de cabeza durante al menos 0,5 h antes de la determinación de CO2.

Las concentraciones de nitrato, nitrito y amonio en muestras filtradas se determinaron utilizando un analizador de inyección de flujo Lachat QuickChem8000 (Lachat Instrument, Milwaukee, WI). Las concentraciones de propano, nitrógeno y dióxido de carbono en el espacio de cabeza se cuantificaron con un cromatógrafo de gases (GC, 7890 A, Agilent, EE. UU.) equipado con un detector de conductividad térmica y una columna empaquetada Shincarbon ST (2 mx 2,0 mm). El cromatógrafo de gases se operó utilizando argón como gas portador (caudal, 28 ml min-1). Las temperaturas del horno, inyector y detector se mantuvieron a 220, 250 y 260 °C, respectivamente. Las concentraciones de propano, nitrógeno y dióxido de carbono se calcularon basándose en una curva estándar externa.

Las muestras marcadas isotópicamente que contenían nitrato y nitrito se dividieron en dos submuestras iguales. Para una submuestra, las fracciones de nitrato y nitrito 15N se midieron con un espectrómetro de masas de relación isotópica (IRMS) Thermo Delta V después de la conversión a N2O46. Para la otra submuestra, el nitrito se eliminó usando ácido sulfámico al 4 % (peso/vol) en HCl47 al 10 % y la fracción 15 N en el nitrato restante se midió mediante IRMS. Luego se calculó la fracción de 15N en nitrito usando la ecuación: fracciones de 15N en (NO3− + NO2−) × cantidad total de (NO3− + NO2−) = fracción de 15N en NO3− × cantidad total de NO3− + fracción de 15N en NO2− × cantidad total de NO2−. Utilizando un método de microdifusión48,49, se atrapó amonio en filtros GF/D (Whatman, Reino Unido) que luego se quemaron para realizar análisis isotópicos mediante IRMS. Se determinaron 29N2, 30N2, propano marcado con 13C y 13CO2 en muestras de gas con un cromatógrafo de gases (7890 A, Agilent, Estados Unidos) acoplado a un espectrómetro de masas cuadrupolo (5957 C inerte MSD, Agilent, Estados Unidos). El cromatógrafo de gases estaba equipado con una columna J&W HP-PLOT Q PT (30 m × 530 μm) y se operó utilizando helio como gas portador (caudal 5,58 ml/min). El horno se mantuvo a 45 °C durante 2 min y luego se calentó a una velocidad de 10 °C/min hasta 60 °C donde se mantuvo durante 6 min. Se detectaron N2, CO2 y C3H8 con un impacto de electrones (EI) de 70 eV utilizando el procedimiento de autoajuste estándar para la calibración de masas. La adquisición se realizó en Cromatografía Iónica Total (TIC) para identificación y en Monitoreo de Iones Seleccionados (SIM) para monitorear señales m/z a 28, 29 y 30 Da (N2), 44 y 45 Da (CO2), 44 y 47 Da ( C3H8) con un tiempo de permanencia de 100 ms para cada señal. El procesamiento de los datos se realizó mediante el programa Chemstation (Agilent, Estados Unidos).

Se tomaron muestras de biomasa (10 ml) del biorreactor de enriquecimiento cada 2 a 3 meses y se sedimentaron mediante centrifugación (8000 × g durante 10 minutos) para la extracción de ADN. El ADN se extrajo utilizando el kit FastDNA SPIN for Soil (MP Biomedicals, EE. UU.) según el protocolo del fabricante. Las concentraciones de ADN se midieron utilizando un espectrofotómetro Nanodrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE). La secuenciación de amplicones para los 16 genes S rRNA (regiones V6 a V8) se realizó utilizando el conjunto de cebadores universales 926 F (5ʹ-AAACTYAAAKGAATTGACGG-3ʹ) y 1392 R (5ʹ-ACGGGCGGTGTGTRC-3ʹ)50 en una plataforma Illumina MiSeq (Illumina, EE. UU. ) en el Centro Australiano de Ecogenómica (ACE; Brisbane, Australia). Los resultados de la secuenciación se procesaron utilizando QIIME250.

El ADN extraído el día 1040 (para el metagenoma inicial) y el día 1100 (para el metagenoma poco profundo) se secuenció mediante bibliotecas de lectura corta de extremos emparejados utilizando un kit de preparación de biblioteca de ADN Illumina Nextera XT y la plataforma NextSeq500 (Illumina, EE. UU.) en ACE. , según el protocolo del fabricante. También se tomaron muestras para la secuenciación metagenómica superficial al mismo tiempo que las muestras para la secuenciación metatranscriptómica para garantizar que la comunidad microbiana fuera consistente con el metagenoma inicial (Figura complementaria 14). Las bibliotecas generaron 149 millones y 1 millón de lecturas en promedio para el metagenoma inicial y superficial, respectivamente (Datos complementarios 1). Los duplicados, adaptadores y bases de mala calidad en las lecturas generadas se eliminaron usando ReadTrim (https://github.com/jlli6t/ReadTrim) con el parámetro “–remove_dups–minlen 100” que internamente llama a FastQC (https://www.bioinformatics.babraham .ac.uk/projects/fastqc/), FastUniq-1.151, cutadapt 2.10 y Trimmomatic-0.3652.

La biomasa del reactor discontinuo (día 1120) también se sometió a secuenciación de lectura larga Nanopore. El ADN se extrajo utilizando el kit Qiagen PowerSoil Pro (Qiagen, Alemania) y se verificó la calidad utilizando una combinación del kit de ensayo Qubit 1x dsDNA HS en el fluorómetro Qubit Flex (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE) y el kit de alta resolución QIAxcel DNA en el sistema QIAxcel Advanced (Qiagen, Alemania). La preparación de la biblioteca se completó de acuerdo con el protocolo del fabricante y se secuenció en un PromethION (Oxford Nanopore Technologies, EE. UU.). La llamada base se realizó utilizando Albacore (https://github.com/Albacore/albacore), lo que resultó en 73 millones de lecturas con calidad > Q5. Entre ellos, 12 millones de lecturas tenían más de 1000 pb con una lectura N50 de 6135 pb. Los adaptadores se recortaron con Porechop v0.2.4 (https://github.com/rrwick/Porechop).

Aviary (https://github.com/rhysnewell/aviary) se utilizó para el ensamblaje híbrido y la agrupación de lecturas cortas y largas, llamando internamente a varios ensambladores y herramientas de agrupación diferentes. Los resultados se comprobaron manualmente utilizando Bandage53. Los contenedores resultantes se organizaron utilizando DASTools 1.1.254. Los genomas recuperados se eliminaron aún más utilizando el flujo de trabajo "desreplicado" en drep-3.2.255 con la configuración predeterminada, lo que dio como resultado un conjunto de genomas no redundantes que consta de 59 genomas de alta calidad. La cobertura de la información del genoma y otros detalles se vieron y verificaron manualmente utilizando IGV 2.11.156. La integridad y la contaminación de los genomas se comprobaron utilizando CheckM v1.1.357. Las lecturas cortas recortadas en calidad se asignaron al conjunto MAG final y a los contigs sin agrupar usando bowtie 2.3.4.3. Se eliminaron las asignaciones con una relación de longitud alineada sobre una lectura <75% o una identidad de región alineada <97%. La abundancia de cada MAG se perfiló utilizando CoverM 0.6.1 (https://github.com/wwood/CoverM) con solo mapeos primarios de calidad. NGA50 y otras características del genoma se calcularon utilizando el paquete Python BioSut (https://github.com/jlli6t/BioSut).

Para todos los MAG y contigs no agrupados, se llamaron marcos de lectura abiertos (ORF) y la anotación primaria de los genomas se realizó utilizando Prokka 1.14.558 con el dominio inferido de la clasificación GTDB-Tk. Se realizó una búsqueda en la base de datos KEGG Orthology HMM (consultada en julio de 2021) utilizando kofamscan 1.3.059, seleccionando el resultado principal para cada gen con un valor e <1e-10 y una medida F máxima. UniRef10060 (consultado en marzo de 2020) se indexó con la base de datos de taxonomía NCBI y se buscó utilizando Diamond61 v2.0.11.149 con 'blastp-sensible'. El resultado principal con valor e <1e-5 e identidad> 30 se seleccionó y se asignó a la base de datos de KEGG Orthology. Se buscó en la base de datos eggNOG v5 utilizando emapper 2.1.5 en modo diamante. Los motivos conservados presentes dentro de los genes predichos relacionados con la oxidación del propano y el metabolismo del nitrógeno se verificaron adicionalmente mediante la búsqueda de dominio conservado del NCBI62. Se utilizaron números KO anotados para inferir la vía codificada en cada genoma. Las vías se identificaron como "no expresadas" si los bloques omitidos > 75% cuando el total de bloques > 5, o los bloques omitidos > 1 cuando el total de bloques ≤ 5.

Se construyó un árbol del genoma bacteriano utilizando la base de datos de taxonomía del genoma (GTDB r202) y se recuperaron genomas bacterianos con un conjunto concatenado de 120 genes marcadores conservados específicos de bacterias inferidos de los genomas. Brevemente, los genes marcadores en los genomas se identificaron usando Prodigal 2.663 y se alinearon usando HMMER 3.364. Los árboles se infirieron utilizando FastTree 2.1.1165 con modelos WAG + GMMA. El arranque se realizó utilizando GenomeTreeTk v0.1.6 (https://github.com/dparks1134/GenomeTreeTk) con un arranque no paramétrico 100 veces. Los árboles se visualizaron utilizando ARB 6.0.666 y se importaron a Adobe Illustrator (Adobe, EE. UU.) para su posterior perfeccionamiento. La clasificación de los genomas se determinó utilizando el flujo de trabajo 'classify_wf' en GTDB-Tk v1.5.167.

Los genes 16S rRNA se identificaron en 'Ca. MAG de A. nitratireducens y genomas de Symbiobacteriia disponibles públicamente en la base de datos. Estos genes se compararon con la base de datos SILVA 138 SSU. Las secuencias seleccionadas y las secuencias del gen 16S rRNA predichas se eliminaron de la replicación utilizando cd-hit 4.8.168. En total, se recolectaron y alinearon 112 secuencias de ARNr 16S utilizando SSU-align v0.1.169. El árbol filogenético se infirió utilizando FastTree 2.1.1165 con parámetros '-gtr -gamma'.

Para análisis filogenéticos de AssA en 'Ca. A. nitratireducens, 24 secuencias de proteínas AssA y BssA de referencia, de más de 700 aminoácidos (los números de acceso de las secuencias de referencia se proporcionan en la Tabla complementaria 6), se descargaron de bases de datos públicas y se alinearon utilizando el músculo 3.8.3170 con el parámetro '-diags1 - maxiters 5'. Los espacios en msa se recortaron usando trimAI 1.4.171. El árbol filogenético se infirió utilizando FastTree 2.1.1165. Para la construcción del gen 16S rRNA y de los árboles de aminoácidos AssA, el cálculo del valor de arranque y la visualización del árbol se realizaron según la construcción del árbol del genoma.

Se realizaron pruebas por lotes por triplicado el día 1100 en tres recipientes de vidrio de 650 ml con una submuestra de 500 ml de biomasa en cada recipiente. La reducción de nitratos en biorreactores se dividió en dos etapas. En la Etapa 1, el nitrato se convirtió principalmente en nitrito y gas dinitrógeno con una producción insignificante de amonio, mientras que en la Etapa 2 se produjeron tanto amonio como gas dinitrógeno. Para la coextracción de ARN y ADN totales, se recogieron 10 ml de un cultivo enriquecido activo de cada lote de prueba en cada etapa y se conservaron agregando solución RNAlater (Sigma-Aldrich) y se dejaron reposar a temperatura ambiente durante 1 h. Luego, la mezcla se filtró a través de un filtro de nitrato de celulosa esterilizado (0,20 µm; Sartorius; Göttingen, Alemania). Para capturar los microorganismos que pueden pasar a través del filtro de 0,2 μm, el filtrado se concentró adicionalmente usando un filtro Amicon® Ultra (Sigma-Aldrich) con un límite de peso molecular de 100 K. ARN y ADN totales en el filtrado concentrado y el filtro de nitrato de celulosa. Luego se extrajeron utilizando el kit RNeasy Powersoil Total RNA con el kit de elución de ADN RNeasy PowerSoil (Qiagen, Alemania) de acuerdo con los protocolos del fabricante. Se eliminaron trazas de ADN genómico de los extractos de ARN con un kit Turbo DNA-free (Thermo Fisher Scientific, EE. UU.) seguido de un kit RNA Clean & Concentrator-5 (Zymo Research, EE. UU.). Se utilizó el kit TruSeq Total RNA Library Prep with Ribo-Zero Plus para la preparación de la biblioteca de ARN siguiendo el protocolo del fabricante. La biblioteca se secuenció en una plataforma NextSeq500 (Illumina, EE. UU.) en ACE (Brisbane, Australia) en ejecuciones de extremos emparejados de 2 × 75 ciclos (Tabla S1).

Las lecturas generadas se recortaron usando ReadTrim (https://github.com/jlli6t/ReadTrim) con el parámetro “–remove_adap –minlen 60”. Se construyó una base de datos de ARNr a partir de ARNr 5 S de arqueas y bacterias de 5SRNAdb72, una base de datos SSU de SILVA73 v138 y una base de datos LSU de SILVA v132. Las lecturas similares al ARN ribosómico se eliminaron utilizando SortMeRNA 4.2.074 con la configuración predeterminada y la base de datos construida como se indicó anteriormente. Las lecturas recortadas en calidad se asignaron a un conjunto de MAG no replicados y a andamios no agrupados usando bowtie2. Se eliminaron las alineaciones con una longitud alineada <95 % de la longitud de lectura o una identidad <97 %. La posible contaminación por ADN de las bibliotecas de ARN se identificó utilizando RNAdir (https://github.com/jlli6t/RNAdir), una versión modificada de dirseq (https://github.com/wwood/dirseq). A continuación, se realizó una prueba binomial utilizando la función scipy.stats.binomtest. Se utilizaron mapeos para calcular el TPM (transcripciones totales por millón)75. Los niveles de expresión total de cada genoma se calcularon como la suma de TPM de todas las secuencias codificantes dentro de cada genoma.

Para la extracción de proteínas, se sedimentaron mediante centrifugación (18.000 x g, 4 °C) 10 ml de cultivo de enriquecimiento recogido de pruebas por lotes de transcriptómica, se lavaron con 1 x PBS y se almacenaron a -80 °C hasta el análisis. Los sedimentos celulares se lisaron en dodecilsulfato de sodio (SDS) al 5%, se incubaron con ditiotreitol 20 mM (concentración final) a 70 °C durante 60 minutos y luego se enfriaron a temperatura ambiente, seguido de alquilación con yodoacetamida 40 mM (concentración final) en la oscuridad durante 30 min. Posteriormente, se añadieron ácido fosfórico al 1,2% (concentración final) y seis volúmenes de tampón de unión S-Trap (90% metanol, concentración final de bicarbonato de amonio 100 mM, pH 7,1). La proteína total se digirió en una columna S-Trap Micro Spin (ProtiFi, Huntington, EE. UU.) de acuerdo con el protocolo del fabricante76. Brevemente, la solución de proteína se cargó en el filtro S-Trap y se centrifugó a 4000 g hasta que pasó toda la solución. El filtro se lavó con 150 μl de tampón de unión S-Trap tres veces y se digirió con 1 μg de tripsina de grado de secuenciación a 47 °C durante 1 h. Los péptidos digeridos se eluyeron secuencialmente usando 40 µl de bicarbonato de amonio 50 mM, ácido fórmico acuoso al 0,1 %, acetonitrilo al 50 % y ácido fórmico al 0,1 % en H2O. Las soluciones peptídicas se secaron antes de resuspenderse en 20 µl de acetonitrilo al 5 % en H2O. Los péptidos se analizaron mediante cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) utilizando un sistema Dionex Ultimate 3000 RSLCnano-LC acoplado a un espectrómetro de masas Q-ExactiveTM HX Hybrid Quadrupole-Orbitrap™ (Thermo ScientificTM). Los datos de secuenciación sin procesar se procesaron buscando en los metagenomas anotados de 'Ca. A. nitratireducens' en Thermo Proteome Discoverer (versión 2.2.0.388). Las proteínas identificadas contenían al menos un péptido único con un límite estricto de tasa de descubrimiento falso (FDR, valor q) inferior a 0,05.

Para la preparación del extracto del metabolito, se recogieron 5 ml de cultivo de enriquecimiento del biorreactor. Las células se recogieron mediante centrifugación (8000 x g, 10 min, 4 °C) y luego se resuspendieron en 1 ml de una mezcla de acetonitrilo-metanol-agua (4:4:2, vol/vol/vol) en tubos de matriz de lisis (MP Biomedicals ) con cuentas de vidrio. Las células se lisaron usando un homogeneizador a base de perlas operado durante 5 ciclos de agitación recíproca a baja velocidad (3000 rpm, 50 s) con enfriamiento en hielo (15 s) entre los pasos de homogeneización. Los extractos se separaron de los restos celulares y las perlas de vidrio mediante centrifugación a 18.000 g durante 10 minutos a 4 °C y se almacenaron a -80 °C hasta su análisis.

Los estándares sintetizados personalizados (succinato de propilo e isopropilo, Best of Chemicals, EE. UU.) y los extractos celulares se secaron en un concentrador de vacío rotacional (Concentrator Plus, Eppendorf) y luego se derivatizaron en 20 µl de cloruro de metoxiamina (30 mg/ml en piridina) con Mezclado continuo durante 2 h a 37 °C. Luego se añadió N,O-bis (trimetilsilil) trifluoroacetamida (BSTFA, 20 µl) que contenía trimetilclorosilano (TMCS) al 1 %. Las muestras se incubaron con agitación continua durante 30 minutos a 37 °C y luego se analizaron utilizando un sistema GC/MS-TQ8050 de triple cuadrupolo de ultra alta sensibilidad (Shimadzu, Japón). El sistema GC estaba equipado con una fuente de ionización EI y funcionaba en modo de monitoreo de reacciones múltiples (MRM) para la detección de compuestos. Se utilizó helio como gas portador a un caudal constante de 1,0 ml/min. Se inyectó un microlitro de la muestra derivatizada en un inyector PTV en modo dividido 1:10 con una temperatura de inyección de 280 °C. Las separaciones se llevaron a cabo en una columna DB-5ms (95% polidimetilsiloxano, 30 mx 0,25 mm x 1 μm) (Agilent JW Scientific). La temperatura del horno se mantuvo inicialmente durante 1 min a 120 °C, luego se aumentó a 220 °C a una velocidad de 8 °C/min, y finalmente se aumentó a 320 °C a 50 °C/min y se mantuvo durante 1 min. La temperatura de la fuente de iones se fijó en 200 °C. Los parámetros espectrométricos de masas específicos se adaptaron a cada compuesto para controlar los iones de fragmentación de cada analito (consulte la Tabla complementaria 7). Se nominaron dos iones fragmentados de la fuente de iones EI y luego se fragmentaron aún más en la celda de colisión. Se eligieron los tres transitorios más abundantes para monitorear. El transitorio 1 se utilizó como cuantificador y los otros dos como calificadores.

La FISH se realizó esencialmente según lo detallado por Daims et al.77. La biomasa del biorreactor se fijó con paraformaldehído al 4% (p/v) y se almacenó en etanol al 50% en PBS a -20 °C. Las sondas FISH se diseñaron utilizando el software ARB70 frente a la versión 13873 de la base de datos Silva SSU Ref NR99, incluidas secuencias relevantes generadas a partir del biorreactor de enriquecimiento. En ausencia de secuencias relacionadas en la base de datos (>92% de similitud), las sondas se diseñaron contra la secuencia 16 S de 'Ca. A. nitratireducens' y se debe tener cuidado en su aplicación más allá de sistemas bien caracterizados. Dado que no hay representantes cultivados disponibles para la validación de la sonda, se diseñaron tres sondas FISH para apuntar a diferentes sitios en el 'Ca. ARNr 16 S de A. nitratireducens para dar mayor confianza en su especificidad. Estos incluyeron el SYMB-1018 (5ʹ - CCG AAG CCC AGC AAA CTC T − 3ʹ), SYMB-624 (5ʹ- TTC GCA AGC ACT CCC GCA – 3ʹ) y SYMB-186 (5ʹ - TCC TCC CGT CCC CAT GC – 3ʹ ) sondas. Se diseñaron sondas auxiliares sin etiquetar78 para apuntar a las regiones flanqueantes de cada sitio de sonda para aumentar la accesibilidad al sitio objetivo para una señal fluorescente óptima (SYMB-1018: H1, 5ʹ - ATT TCT AGA GCG GTC AGG GGA TGT − 3ʹ; H2, 5ʹ - CAC CTG TCT CCC TGT CTG GA − 3ʹ; SYMB-624: H1, 5ʹ - GTT AAG CTG CGG GTT TTC ACT CAC − 3ʹ; H2, 5ʹ - CTG CCC TCA AGC CCA ACA GT − 3ʹ; SYMB-186: H1, 5ʹ - GGC CGT GAG CAT ATC CGG TAT TAG C − 3ʹ; H2a, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGC AGT AAA CCT T − 3ʹ; H2b, 5ʹ - GAC CCA TCC CGA AGT AGC AAC CCT T − 3ʹ). Se aplicaron sondas auxiliares en cantidades equimolares con su sonda respectiva. Los extremos 5' y 3' de las sondas oligonucleotídicas FISH se marcaron con el fluoróforo Cy3 y fueron sintetizados por Integrated DNA Technologies, Singapur. Se logró una señal más alta para estas sondas FISH con pretratamiento con lisozima de la biomasa (0,5 mg ml-1 en EDTA 0,05 M, Tris-HCl 0,1 M, pH 8) durante 30 minutos a temperatura ambiente. La sonda sin sentido Non-EUB se utilizó como control de hibridación negativo79. La tinción de células con DAPI (1 ng/μl) se realizó durante 15 minutos en la oscuridad. La biomasa marcada se visualizó con un microscopio confocal láser de luz blanca Stellaris5 (Leica, Alemania).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Los datos de secuenciación se archivan en la base de datos NCBI con el número de proyecto PRJNA802347. Todos los borradores de secuencias de nucleótidos del genoma se enviaron al NCBI con los números de acceso SAMN25643198 a SAMN25643256. Los datos de proteómica de espectrometría de masas se depositaron en el Consorcio ProteomeXchange a través del repositorio de socios PRIDE con el identificador de conjunto de datos PXD031366. Los datos originales se proporcionan con este documento.

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Descargar referencias

Agradecemos a A. Oren (Universidad Hebrea de Jerusalén) por sus sugerencias sobre el nombre de 'Ca. A. nitratireducens', G. Talbo y L. Liu por su ayuda con la extracción de proteínas y el análisis de datos proteómicos, Y. Wang y C. Lai por su ayuda con la operación del biorreactor, X. Zhang y S. Hu por el mantenimiento del cromatógrafo de gases, N. Clayton, N. Dawson y J. Li por los análisis químicos, A. Tabrett y A. McInnes por su ayuda para optimizar las sondas FISH y E. Larsen por su ayuda con la edición. JL cuenta con el apoyo de la beca de formación en investigación de la UQ. JG, SM y GT cuentan con el apoyo de las futuras becas FT170100196, FT190100211 y FT170100070 del Consejo Australiano de Investigación (ARC), respectivamente. ZY cuenta con el apoyo de ARC Australian Laureate Fellowship (FL170100086).

Estos autores contribuyeron igualmente: Mengxiong Wu, Jie Li.

Centro Australiano de Biotecnología Ambiental y del Agua, Facultad de Ingeniería, Arquitectura y Tecnología de la Información, Universidad de Queensland, Santa Lucía, QLD, Australia

Mengxiong Wu, Jie Li, Zhiguo Yuan y Jianhua Guo

Centro de Investigación del Microbioma, Facultad de Ciencias Biomédicas, Universidad Tecnológica de Queensland (QUT), Instituto de Investigación Traslacional, Woolloongabba, QLD, Australia

Andy O. Leu, Gene W. Tyson y Simon J. McIlroy

Centro de Investigación de Biogeoquímica Costera, Facultad de Ciencias e Ingeniería, Universidad Southern Cross, Lismore, Nueva Gales del Sur, Australia

Dirk V. Erler

Metabolomics Australia (Queensland Node), Instituto Australiano de Bioingeniería y Nanotecnología, Universidad de Queensland, Santa Lucía, QLD, 4072, Australia

Tierra Stark

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JG concibió el estudio. MW, JG y SM planificaron los experimentos. MW enriqueció los microorganismos en el biorreactor y realizó experimentos de balance de masa y electrones y etiquetado de isótopos. DE realizó las mediciones de nitrógeno isotópico. TS estableció métodos para los análisis de isótopos de carbono y metabolitos. SM diseñó sondas FISH y realizó microscopía FISH. MW realizó el muestreo, la preservación, las extracciones de ADN, ARN y proteínas para la secuenciación metagenómica, metatranscriptómica y metaproteómica. MW, JG y ZY realizaron el análisis de los datos del proceso. JLAL, MW, GT, SM y JG realizaron el análisis de la comunidad microbiana y el análisis bioinformático. MW, JL, ZY, SM y JG escribieron el manuscrito en consulta con todos los demás autores.

Correspondencia a Simon J. McIlroy o Jianhua Guo.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a Florin Musat y al otro revisor anónimo por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

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Reimpresiones y permisos

Wu, M., Li, J., Leu, AO et al. Oxidación anaeróbica de propano acoplada a reducción de nitrato por un linaje dentro de la clase Symbiobacteriia. Nat Comuna 13, 6115 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33872-y

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Recibido: 12 de abril de 2022

Aceptado: 05 de octubre de 2022

Publicado: 17 de octubre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33872-y

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